Félix Fernández, ya antiguo y aventajado alumno, fue su instructor más inmediato. Diez años después, inquieto y talentoso, encara la tarea de superar la dificultad que ofrecía la escritura de la música paraguaya para su ejecución, especialmente por músicos extranjeros. Por entonces, ya había concluido sus estudios de Teoría y Solfeo, y estaba reemplazando el trombón de la banda por el violín.
Profundizó sus estudios con Carlos Esculies y Leopoldo Centurión en el Gimnasio Paraguayo.
Es así como, producto de afanosos estudios y experimentos, logra crear la guarania, en el año 1925, alentado por sus compañeros Félix Fernández, Manuel Rivas Ortellado, Rudencindo Lugo, Darío Gómez Serrato, Silvestre Jovellanos, Santiago Torres, Manuel Cardozo y Gerardo Fernández Moreno, para quienes Flores siempre manifestó su gratitud. La guarania nació de unos arreglos hechos por Flores a la polka Maerãpa reikuaase, de Rogelio Recalde.
Jejuí fue la primera guarania, y le siguieron Arribeño Resay, India y Ka’a ty, con letra de Rigoberto Fontao Meza (posteriormente, Ortiz Guerrero escribió la letra actualmente conocida de India).
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Con Ortiz Guerrero, a quien conoció en el año 1928 por invitación de Darío Gómez Serrato, produjo las más bellas páginas del repertorio popular, especialmente en el género de guaranias. Y la guarania India, junto con la canción épica Cerro Corá, de Félix Fernández y Herminio Giménez, fueron declaradas música oficial por decreto del Gobierno, el 24 de julio de 1944.
India, Nerendápe aju, Panambi vera, Paraguaýpe, Buenos Aires, salud, Kerasy, Nde ratypykua, Obrerito, Gallito cantor, Purahéi paha, Mburicao, Ñasaindýpe, Ñane aramboha, Punta Karapãme Serratondive, Cholí, Musiqueada che ámape, Ka’aty, Arribeño resay y otras más serían suficientes para colmar las ambiciones de cualquier creador, pero Flores encara más adelante el desafío de llevar la música paraguaya a los niveles de la sinfonía. Y en 1944, estrena en Buenos Aires Pyhare pyte. Luego vendrían Ñande Ru Vusu, María de la Paz y otras, totalizando doce sinfonías.
Con Catalina Bogado Cantero, son sus hijos Francisco Asunción y Olga Flores, y de otra madre, Juana de Dios Flores.
José Asunción Flores murió en el exilio el 16 de mayo de 1972, en la ciudad de Buenos Aires. Sus restos fueron repatriados en 1991, y descansan en la plaza de Mariscal López y Choferes del Chaco, Asunción, plaza que lleva su nombre y el de su entrañable amigo y coautor, Manuel Ortiz Guerrero.